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抗体偶联药物ADC - 连续流合成
点击次数:483 发布时间:2022-09-28

研究背景


抗体偶联药物(ADC,Antibody-drug conjugates),是将类似于化疗的细胞毒性药物与单克隆抗体连接在一起,从而实现对肿瘤组织的靶向杀伤功能。其结合了靶向疗法和化疗疗法的作用原理,具有靶向性高,特异性强,毒副作用小等优点。


早在2015年,Jones团队利用流动化学实现通过小分子标签加工蛋白质(包括抗体)的可行性,并成功地利用直接的一步生物偶联天然赖氨酸侧链,对蛋白质和抗体进行修饰。( 请参考:J. Flow Chem. 2015, 5, 151-154)


但在ADC中,由于抗体中有超过80个暴露的且具备反应活性的赖氨酸残基。如此多的活性位点会使得偶联反应产生多种偶联混合物。ADC的连续化合成目前未见有报道。


结合之前Jones的工作,研究者决定尝试以连续流反应器合成ADC。


ADC合成概述


通过半胱氨酸等内源性氨基酸,在二硫键间的连接位点合成ADC是一种常见的方法。这种偶联方法需要对蛋白质分子进行氧化还原,以释放活性硫醇部分。


该生物偶联过程可分为两个步骤: 通过三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原抗体,然后巯基与马来酰亚胺药物偶联(如图1)。

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图1. 半胱氨酸基ADC的合成方案


这种偶联技术具有优势,因为其控制的药物-抗体比(DAR)(典型DAR值在3.5 - 8之间)和相对较低的异质性,目前主要使用传统的间歇反应器进行合成。


作者使用连续流反应器和传统的含马来酰亚胺药物连接剂生产ADC,开发出一种连续制备9个半胱氨酸偶联ADC的工艺(图2),在几分钟内从天然抗体实现ADC合成,且所得ADC的目标DAR和聚集特性与市售ADC相似。


DAR简介


DAR(Drug-to-Antibody Ratio,药物抗体比值)是抗体药物偶联物的一个关键属性,是ADC药物研发过程重要的质控环节。ADC药物从本质上讲是混合物,是由连接不同个数小分子药物的单抗组成。


DAR代表的是每个单抗上连接小分子药物的平均数量。DAR直接影响ADC药物的疗效和安全性,药物研发阶段应尽量缩小DAR值的变动区间。



研究过程

一. 连续流工艺


作者基于之前使用连续流反应器的经验,此次使用的是V型混合器+管式反应器。实验设计时,除了考量反应时间和温度,管式反应器的长度也是此次工艺优化的关键变量。


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图2. 连续流合成流程图


管式反应器的长度直接影响反应时间(反应器1用于TCEP还原,反应器2用于药物偶联。  因此,作者评估了反应器长度和产生的ADC的 DAR之间的关系(表1)。


在初步可行性研究中,作者选择曲妥珠单抗(Trastuzumab)和药物连接剂MMAE进行偶联。通过反相高效液相色谱(RP)分析,将间歇反应器和连续流法生产的ADC进行了直接比较。


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表1. 间歇式反应器和连续化反应结果比对


二. 工艺条件研究


  • 在间歇法的生物偶联中,通常需要超过1小时的时间来完成ADC偶联步骤。

  • 而使用管式反应器,在37℃下进行3min TCEP还原,然后在25℃下偶联药物 3min,得到的ADC的测量DAR值为3.2(表1,条目1)。

  • 当偶联反应时间降低到1.5 min时,得到的ADC的DA值R没有变化(表1,条目2)。

  • 偶联时间进一步降低到0.75 min也没有显著降低,但将Reactor-2停留时间降低到0.38 min,得到的ADC的DAR值小于2。

  • 还原步骤(Reactor-1)的时间从3min减少到1.5min也导致ADC的DAR值小于2。


三. 反应底物的拓展


作者进一步评估了其他抗体和药物连接子,以验证连续流化学方法合成ADC的普遍性和可靠性。


如表2所示:通过连续流反应器,作者制备9个半胱氨酸偶联ADC,都取得了不错的结果。

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表2. 底物拓展研究实验


总结


  • 使用连续流技术实现ADC合成;

  • 通过优化反应时间,温度等因素,开发了9种ADC的连续流合成工艺;

  • 连续流动化学可用于开发一种可靠而稳健的ADC生产工艺;

  • 连续流工艺可与间歇式生产的ADC相媲美,并显著缩短反应时间;

  • 连续流工艺易于放大的特点,更容易实现放大生产。

参考文献:Org. Process Res. Dev. August 31, 2022


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